目前全长转录组测序（Iso-seq）技术的优势逐渐被广大学者所熟知，主要体现在对新基因/新isoform的挖掘、对可变剪切（AS）、可变聚腺苷酸化（APA）、融合基因、LncRNA等的预测及分析。可谓是三代测序一出手，基因组注释“全”都有。下面小编以2篇经典案例带大家深入了解全长转录组在揭示转录组复杂性、辅助基因组注释方面的具体应用~

文献名称：全长转录组测序揭示斑马鱼高分辨率基因注释[1]

发表期刊：Genome Research

发表时间：2018 年7 月

样本选择：转录抑制剂处理前后的15个斑马鱼胚胎，处理后的胚胎停留在ZGA（合子基因激活）阶段前。斑马鱼早期胚胎发育由其母本遗传物质驱动，经历ZGA阶段后一些发育必需基因才开始发生转录。

实验设计

图1 实验设计流程图[1]

实验结果

01 全长转录组数据概览

作者利用三代测序获得斑马鱼胚胎的全长转录本序列信息，并比对参考基因组，共有18,777条转录本成功比对，仅3.6%未能比对上，map率远高于短读长测序的结果（低于80%）。在对新转录本的研究中，获得了4,205条（22.4%）被认为是潜在新转录区（NTR）的转录本与5,295条（28.2%）新isoform。 图2 长读长转录组特征概览[1]

02 NTR区转录本分析

作者对有高度编码潜力的NTR进行序列同源性和功能域分析，共鉴定到3,255个具有高度编码潜能的NTR。首次发现斑马鱼的一个NTR位点与人的HIST2H2BE基因具有同源性，是组蛋白变体的直系同源，且此变体仅在对照组样品中出现，因此猜测此变体起源于斑马鱼的受精卵。

将非编码的NTR进行保守性和功能分析，发现有258个非编码NTR的保守性在进化中有所提高。通过与Rfam数据库比对，共匹配上76条，其中一个NTR与mir-548相匹配，只在处理组样品中表达，推测其RNA多数从母本中来；它的一个3’端较短的isoform则出现在对照组中。匹配上的miRNA位于延长的3’端，可能是假定的靶点或miRNA结构本身，并调控了母本向合子转变的过程。

图3 推测的新miRNA同系物[1]

03 新isoform分析

作者对已知基因位点的新isoform进行了分析，新发现的可变剪切事件超过2,000件。利用二代转录组数据将其进行定量，通过对比胚胎早期和晚期样本，发现胚胎晚期阶段可变3’UTR和内含子保留的isoform有明显的增加。对可变剪切事件的验证中，作者还发现一条含有多个mir-430重复序列的8kb新转录本，是胚胎早期发育的重要驱动。该研究揭示了斑马鱼胚胎转录组的复杂性，并为其提供了高分辨率的注释资源。

图4 可变剪切分析[1]

文献名称：全长转录组测序揭示自交系玉米遗传多样性[2]

发表期刊：Plant Biotechnol Journal

发表时间：2018 年12 月

样本选择：自交系玉米W64A授粉后16天的硬质胚乳

实验设计

图5 玉米实验设计流程图[2]

主要结果

01 全长转录组测序数据概览

作者利用全长转录组测序共获得166,693条高质量全长转录本，将这些序列比对到参考基因组上，鉴定到3,399个新基因位点和75,711个已知位点的新isoform。对新isoform的分析发现W64A与B73品系具有相似的可变剪切模式，可变3’与可变5’形式比外显子跳跃和内含子保留形式更多。除此之外，作者还对lncRNA和融合基因进行了数量统计和分类比较。经过严格的参数设定，共识别了1,051个SSR和243个InDel，并且分别有63%和58.8%的分子标记得到了验证。

图6 玉米胚乳性状表现/转录本特征分析[2]

02 胚乳质地的相关基因序列多样性分析

为理解透明胚乳形成原因，作者对涉及胚乳质地的相关基因进行了探究。硬质相关基因有相似的拷贝数，包括zein蛋白和non-zein蛋白、酶和转录因子基因等，平均序列多样性为3.92%，最高达26.9%。编码基因中“TTAT”的缺失造成阅读框移码突变从而编码提前终止，使得一个18-kDa的蛋白在W64A品系中不表达，而在B73品系中表达。之后对比这两个品系玉米的其他基因，包括19-和22-kDa蛋白的编码基因在内，有超过20%表现出序列变化。O1基因编码区的2个InDel使O1蛋白的氨基酸数量发生改变，从而产生不透光的胚乳。这些基因的突变导致蛋白编码提前终止，因此对玉米胚乳的性状产生了影响。本项研究中，全长转录组测序不仅揭示了玉米胚乳转录组的复杂性，还为优良性状筛选和遗传育种提供了丰富的分子标记资源。

图7 SSR和InDel分布及验证[2]

以上两篇文献借助Iso-seq技术实现了全长cDNA序列从5’到polyA尾的全部信息捕获，有利于对编码区域、调控元件和分子标记的精准识别，极大地提高了对应物种的注释完整度，为后续研究贡献了丰富的高精度注释资源。

作为目前国内三代测序的优质服务商，安诺优达拥有10台PacBio Sequel测序平台，搭建了业界先进的基因组组装、结构变异检测、全长转录组等数据分析体系，积累了丰富的物种及合作项目经验，具备快速的项目交付周期。专业的技术团队致力为您提供优质、高效的测序及分析服务，期待与您的合作。

参考文献：

[1] Nudelman German, Frasca Antonio, Kent Brandon, et al. High resolution annotation of zebrafish transcriptome usinglong-read sequencing[J]. Genome Research, 28, 1415-1425.

[2] Zhou Yong, Zhao Zhixuan, Zhang Zhiyong, et al. Isoform sequencing provides insight into natural genetic diversity in maize[J]. Plant Biotechnol Journal.

邀您关注近期会议

2019年5月17日安诺优达生命科学研究院联合上海交通大学共同举办“表观遗传学与前沿基因组学技术研讨会”。会议以“单细胞和三维基因组学技术”为探讨对象，拟邀多位院士、专家、科研工作者分享两大技术在相关研究领域的最新前沿动态、研究成果。期待您的参与~