还没来得及好好享受凉爽的秋日，小编就受到了来自帝都妖风的魔法攻击，只好一边把秋衣秋裤从衣橱底层翻出来，一边质问为什么前几日贴上的秋膘没起半点作用( ´╥ω╥`)。

除了火锅和羽绒服，很多奋斗在科研一线的小伙伴还会选择到实验室避寒，不只是因为实验室的暖气最足，毕竟理想的实验结果出来才是对我们最大的安慰( •̀∀•  )。好不容易完成了组织分离，核酸提取，文库构建，终于到了最关键的一步——上机测序。不少小伙伴会有疑问：什么样的文库是符合上机要求的呢？质检报告会提供哪些信息？Illumina平台是怎样测序的呢？想知道答案，就快来看看小编为您准备的NGS文库测序攻略吧～

1. 送样篇

Q：什么样的文库是符合上机要求的呢？

A：首先需要确认文库的机构是否符合Illumina平台的上机要求，其次文库的片段大小、体积、浓度等需要符合相应平台的上机标准。安诺基因拥有HiSeq X Ten、NovaSeq 6000、NextSeq 550AR以及MiSeq测序平台，能够为您提供合适的测序策略，满足您多样的需求。我们列出了不同平台的上机标准，您还可以联系各地区的销售经理获取详细的送样建议。

表1 HiSeq X/NovaSeq 6000平台上机文库标准

表2 NextSeq 550AR/MiSeq平台上机文库标准

2. 质检篇

Q：文库如何进行质检？质检报告会提供哪些内容呢？

A：上机之前，我们会使用Agilent 2100 或 LabChip GX Touch 生物芯片分析系统检测文库片段大小，并使用StepOnePlusTM Real-Time PCR System 进行 QPCR，对文库的有效浓度进行定量，并在质检报告中判定该文库的片段大小和浓度是否符合上机要求。

Q：文库质检不合格的原因有哪些？会造成什么影响？有哪些解决方案？

A：常见的文库质检不合格原因：

1）浓度低

影响：浓度偏低的文库可能定量不准，影响该文库的产出；在与正常文库pooling时，可能导致pooling后的浓度达不到上机要求，影响整条lane的产出。

解决方案：提高建库起始量和纯化回收效率，或适当增加建库过程中扩增循环次数，但是增加扩增次数也会导致dup率增加。

2）二聚体污染

影响：非目的片段会给文库的定量带来误差，影响文库产出。此外，二聚体的优势扩增会导致整条 lane 文库有效数据产出偏低，影响 clean reads 的比率。

图1 二聚体污染

解决方案：适当减少建库过程引物用量；调整文库纯化时磁珠的比例。

3）小片段污染

影响：非目的片段会给文库的定量带来误差,影响文库产出。此外，小片段的优势扩增会导致同一条 lane 其它文库产出偏低,接头污染 reads 增多，影响 clean reads 率，影响有效数据比例。

图2 小片段污染

解决方案：优化片段打断和文库纯化条件，如果小片段是目的片段，可以包lane测序，并选择较短的测序读长。

4）大片段污染

影响：首先非目的片段会给文库的定量带来误差，影响文库产出。其次文库片段偏大，成簇时可能会跨孔长簇，这部分数据会被仪器过滤掉，影响数据产出。此外，较长的文库片段也会形成较大的簇，会导致荧光信号减弱，机器在碱基识别时，准确率降低，Q30 降低，同时也会影响数据量。

图3 大片段污染

解决方案：优化片段打断条件。

5）二峰图过宽

影响：峰图过宽会给文库的定量带来误差，影响文库产出。且文库片段分布偏大或偏小会影响数据产出和Q30，可参考小片段污染和大片段污染。

解决方案：优化片段打断和文库纯化条件。

3. 测序篇

Illumina平台的核心原理是边合成边测序。在测序的过程中，Read1、Index7、Read2的测序引物依次与模板结合。以HiSeq X平台PE150试剂为例，如果只有P7端存在8位Index，那么测序时Read1+Index7＋Read2的反应数是150+8+150 cycles；如果需要测8位的Index7和Index5，测序的顺序就是Read1+Index7+Index5＋Read2，反应数为150+8+8+150 cycles。需要注意的是HiSeq X平台在对文库的Index7和Index5测序时，模板链是反向互补的，而NovaSeq 6000平台对双端Index测序时模版链则是同一条，也就是说同样的Index5序列在不同平台上测到的序列可能是反向互补的，因此在填写Index序列时需要选择测序平台对应的序列。

近期，我们推出了全新的快速周期产品：NovaSeq S4试剂单一文库包lane测序，从样本接收到云交付仅需3天，硬盘交付仅需4天。HiSeq X单一文库包lane测序6个自然日即可交付结果。希望以上的分享能够对各位老师有所帮助，文库送到安诺了，实验结果的春天还会远吗～

文章来源：安诺基因