1 材料

1.1 动物

雄性Wistar大鼠，体重60g±10g。

1.2 试剂

M199(Hyclone)，DMEM(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，内皮细胞生长因子(ECGF，ROCHE)，肝素钠，青链霉素(HyClone)，明胶(Sigma)，Ⅱ型胶原酶(GIBCO)，胰蛋白酶(Hyclone)， PBS，1%明胶PBS溶液。

培养液：DMEM，25%胎牛血清，150μg/mlECGF，100U/ml肝素钠，100U/ml青链霉素；

冲洗液：M199，8%新生牛血清，100U/ml肝素钠，100U/ml青链霉素。

1.3 仪器

CO2培养箱，15ml匀浆器；消毒手术器械、75 μm及145 μm尼龙滤网。

2 方法

雄性Wistar大鼠，3.5%水合氯醛腹腔麻醉，断头后浸泡于75%酒精中2分钟，无菌条件下取脑。将鼠脑在PBS中冲洗2遍后，在冲洗液中剥离软脑膜及肉眼可见的大血管，去除大脑白质及小脑，收集大脑皮质，充分剪碎。将剪碎的脑组织制成匀浆后过145 μm滤网，取滤液过75 μm滤网，弃滤液，用冲洗液冲洗并收集滤网上的血管段。将血管段置于2个离心管内于1500 rpm离心8 min后加入0.1% Ⅱ型胶原酶在37℃水浴中消化15 min，1500 rpm离心5 min，冲洗液吹打均匀后1500 rpm离心5 min，反复3次，最后1次离心后，弃上清，用培养液重悬沉淀，制成大鼠脑微血管段悬浮液，接种于预先铺好明胶的培养瓶中。在CO2培养箱中孵育1.5 h后，小心吸弃上清液的一半，培养3天后换液。7-8天细胞长成融合状态，1:2传代，细胞传代至第3代用于实验。

3 结果

原代培养时，单个大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC)呈多角形或梭形。当细胞生长成片时，单层生长，连接紧密，呈典型的铺路石样。传代细胞，呈短梭形，连接紧密。详见下图。

普通光镜下rCMEC图

4 讨论

本方法的原理是，在匀浆前尽可能去除大血管和白质，匀浆后过145 μm 滤网，去除小血管及神经胶质；过75 μm 尼龙滤网，去除神经细胞和血细胞，这样就可获得较纯的微血管段。在胶原酶的作用下，使rCMEC与基底膜结合松弛，易于分离。种植后，已与基底膜呈半结合状态的rCMEC迅速“爬出”微血管段，逐渐生长成片。但其中尚夹杂有神经细胞、胶质细胞、成纤维细胞及血管平滑肌细胞。由于EC贴壁快，在1-3 h内即开始贴壁，而神经细胞、胶质细胞和血管平滑肌细胞贴壁需要更长时间，所以采取接种后1.5 h吸去上1/2培养液，去除大部分杂质细胞。

在第一次传代时，采取高密度接种，利用VEC快速贴壁的特点，有效占据生长空间，从而抑制其它细胞的生长。此外，培养液中给予较高浓度的内皮细胞生长因子(150 μg/ml)，促进内皮细胞增殖，高浓度的牛血清(25%)一方面促进VEC增殖，另外一方面抑制成纤维细胞生长。

因此，经过两次传代后，rCMEC的纯度基本接近100%，细胞状态非常稳定，可用于实验。