摘要 归纳植物DNA 提取各个环节,同时对DNA 提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。
关键词 植物;总基因组DNA;提取;纯化;进展
Advances of Genome DNA Extraction and Purification in Plants
Abstract The techniques of plant DNA extraction were studied. And the causes and the countermeasures of common problems in the DNA extraction were analyzed.
Key words Plant ; Genome DNA; Extraction ; Purification ; Advance
DNA 提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前,已经发展了多种方法,成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下, 不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,在提取基因组DNA 时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理[1] 。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA 由于多酚被氧化成棕褐色,多糖、单宁等物质与DNA 会结合成粘稠的胶状物,获得的DNA 常出现产量低、质量差、易降解,影响了 DNA 质量和纯度,不能被限制性内切酶酶切,严重的甚至不能作为模板进行PCR 扩增。针对这一现象,已有许多学者对植物特别是顽拗型木本植物的基因组DNA 提取纯化进行了改良和发展。笔者就植物DNA 提取各个环节,如样本的采集与保存、提取缓冲液成分的作用、DNA 提取纯化方法等进行归纳,同时对DNA 提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。
1 植物样品的采集与保存
植物组织材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料,采集的过程中应尽可能使组织材料保持水分,在取样时立即用浸湿的纱布包裹采集的组织材料,放置在密闭的冰盒中,这样可使组织材料3～5 d 仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时,在可能的条件下冷冻保存(如放置于液氮中) ;当不具备冷冻条件时, 最好用盛有无水CaSO4 的瓶子分别保存, 使其迅速干燥, 这种方法可将材料保存数月,返回后应尽快进行DNA 的提取工作。对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料, 应尽可能采集幼嫩组织外, 最好进行冷冻保存并在短时间内进行DNA 提取。植物组织材料的化学保存法,如乙醇、丙二醇处理法,通常会导致DNA 剧烈降解, 因此,不作为推荐的保存方法[2] 。对于采集回来的样品如要长期保存,应经液氮处理后贮存在- 80 ℃冰箱或直接储放于液氮中,且在与提取缓冲液接触前,应防止冰冻的样品在空气中融化,否则酚类易被氧化。
2 提取缓冲液
随着现代分子生物学的发展, DNA 分离技术也层出不穷, DNA 已经可以从诸如化石、木乃伊等极端材料中分离出来, 也可以从痕量材料获得DNA。无论是什么材料, 针对不同的来源和特点, 调整设计相应的提取缓冲液及不同的技术方案是十分重要的。在实际应用中可针对不同的情况对具体实验方案的各个部分进行不同组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化,缓冲液的pH值、保护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化。十二烷基磺酸钠(SDS) 是一种阳离子强表面活性剂, 通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用; 而十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的复合物, 低盐浓度下可沉淀的表面活性剂。乙二胺四乙酸(EDTA) 可用于抑制金属离子依赖性的酶(螯合Mg2 + 、Ca2 + ) 的活性。牛血清白蛋白(BSA) 可使一些降解酶的表面变性。还原型巯基成分如 β2巯基乙醇、谷胱苷肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇等一些硫醇类物质,通常可用于保护DNA 免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等物质的损害。加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 也可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响。还有其他一些非通用添加物,如抗坏血酸、维生素C 可用于降低醌类物质的影响, 精胺及其他多胺可用于降低核酶的影响,氰化物可用于降低重金属氧化酶的影响。另外还有在提取液中加入活性炭、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、重过亚硫酸钠、硼砂等物质防止多酚类物质氧化的报道[3 - 4] 。
3 DNA提取方法
3. 1 传统的DNA提取方法 传统的DNA 提取与纯化,如 CTAB 法、SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。 CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( < 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康,因此使该方法的应用受到一定的局限性。
摘要 归纳植物DNA 提取各个环节,同时对DNA 提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。
关键词 植物;总基因组DNA;提取;纯化;进展
Advances of Genome DNA Extraction and Purification in Plants
Abstract The techniques of plant DNA extraction were studied. And the causes and the countermeasures of common problems in the DNA extraction were analyzed.
Key words Plant ; Genome DNA; Extraction ; Purification ; Advance
DNA 提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前,已经发展了多种方法,成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下, 不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,在提取基因组DNA 时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理[1] 。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA 由于多酚被氧化成棕褐色,多糖、单宁等物质与DNA 会结合成粘稠的胶状物,获得的DNA 常出现产量低、质量差、易降解,影响了 DNA 质量和纯度,不能被限制性内切酶酶切,严重的甚至不能作为模板进行PCR 扩增。针对这一现象,已有许多学者对植物特别是顽拗型木本植物的基因组DNA 提取纯化进行了改良和发展。笔者就植物DNA 提取各个环节,如样本的采集与保存、提取缓冲液成分的作用、DNA 提取纯化方法等进行归纳,同时对DNA 提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。
1 植物样品的采集与保存
植物组织材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料,采集的过程中应尽可能使组织材料保持水分,在取样时立即用浸湿的纱布包裹采集的组织材料,放置在密闭的冰盒中,这样可使组织材料3～5 d 仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时,在可能的条件下冷冻保存(如放置于液氮中) ;当不具备冷冻条件时, 最好用盛有无水CaSO4 的瓶子分别保存, 使其迅速干燥, 这种方法可将材料保存数月,返回后应尽快进行DNA 的提取工作。对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料, 应尽可能采集幼嫩组织外, 最好进行冷冻保存并在短时间内进行DNA 提取。植物组织材料的化学保存法,如乙醇、丙二醇处理法,通常会导致DNA 剧烈降解, 因此,不作为推荐的保存方法[2] 。对于采集回来的样品如要长期保存,应经液氮处理后贮存在- 80 ℃冰箱或直接储放于液氮中,且在与提取缓冲液接触前,应防止冰冻的样品在空气中融化,否则酚类易被氧化。
2 提取缓冲液
随着现代分子生物学的发展, DNA 分离技术也层出不穷, DNA 已经可以从诸如化石、木乃伊等极端材料中分离出来, 也可以从痕量材料获得DNA。无论是什么材料, 针对不同的来源和特点, 调整设计相应的提取缓冲液及不同的技术方案是十分重要的。在实际应用中可针对不同的情况对具体实验方案的各个部分进行不同组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化,缓冲液的pH值、保护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化。十二烷基磺酸钠(SDS) 是一种阳离子强表面活性剂, 通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用; 而十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的复合物, 低盐浓度下可沉淀的表面活性剂。乙二胺四乙酸(EDTA) 可用于抑制金属离子依赖性的酶(螯合Mg2 + 、Ca2 + ) 的活性。牛血清白蛋白(BSA) 可使一些降解酶的表面变性。还原型巯基成分如 β2巯基乙醇、谷胱苷肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇等一些硫醇类物质,通常可用于保护DNA 免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等物质的损害。加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 也可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响。还有其他一些非通用添加物,如抗坏血酸、维生素C 可用于降低醌类物质的影响, 精胺及其他多胺可用于降低核酶的影响,氰化物可用于降低重金属氧化酶的影响。另外还有在提取液中加入活性炭、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、重过亚硫酸钠、硼砂等物质防止多酚类物质氧化的报道[3 - 4] 。
3 DNA提取方法
3. 1 传统的DNA提取方法 传统的DNA 提取与纯化,如 CTAB 法、SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。 CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( < 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康,因此使该方法的应用受到一定的局限性。
3. 2 DNA提取新方法 近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA[5] 。已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。马小军等将CTAB 液提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard 纯化系统纯化得到的DNA ,RAPD 扩增效果良好,产率达2 250μg/ g[6] 。张博等用硅珠(SiO2) 颗粒吸附DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品[7] 。黄椰林等对常规CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN 的APCR 产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料[8] 。袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA[9] 。目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。国内的生物公司发展迅速,如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低。除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取和PCR 扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。另外,还有高通量的DNA 提取产品,如高通量组织细胞研磨仪MM301 ,在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48 个甚至192 个。美国应用生物系统公司6100 型核酸提取仪,可用于RNA、DNA 的提取纯化,可自编程序, 可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96 个样品。
4 DNA纯化及杂质去除
4. 1 酚类杂质的去除 对植物中次生产物酚类物质的去除,普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂,防止多酚氧化褐变。在提取DNA 过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及抗坏血酸等巯基试剂,抑制氧化反应,避免褐化。在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮) 等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用。因此在提取液中加入适量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的纯度) ,其用量视杂质的多少而定(1 %～6 %) ,PVP 同时能有效去除多糖。因此将PVP 和巯基乙醇配合使用并调整用量,能够有效地防止多酚污染。王玉成等认为以上的方法仅对褐化现象较轻者有效,却很难克服一些含酚类化合物丰富的植物,如柽柳、冷杉等树种的褐化。在CTAB 缓冲液加入一定量的硼砂(提取缓冲液含0. 012 5 mol/ L 硼砂、2 % CTAB 、 1. 4 mol/ L NaCl 、巯基乙醇0. 1 mol/ L ,pH值为9. 0) 提取柽柳、冷杉的RNA 取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物组织的RNA 时也从未发生褐化[10] 。
4. 2 多糖类杂质的去除 多糖的污染是提取植物DNA 时常遇到的另一棘手的问题[11] 。植物组织中往往富含多糖, 而多糖的许多理化性质与DNA 很相似,因此很难将它们分开。经典的CsCl 梯度离心能有效的除去植物中多糖,但梯度离心设备昂贵,操作不便且DNA 得率很低。近年国内外有一些去除多糖的相关报道,Dellaporta 等认为加入高浓度的 KAc 有利于除去多糖[12] ;Fang 等认为在1. 0～2. 5 mol/ L NaCl 的高盐TE 中,用无水乙醇沉淀DNA 能除去多糖[13] ; Sue Porebski 等在沉淀粗提DNA 时,将NaCl 的浓度提高至2. 5 mol/ L 以除去多糖[14] ;Candelario 等通过调节材料的取样时期、使用量, 在氯仿处理后加含2 %CTAB 的分离缓冲液, 及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖[15] ;徐志祥等将DNA 沉淀重悬于30 %乙醇中4 ℃放置过夜,离心, 上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA ,能去除多糖和其他杂质[16] ;陈大明等利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其他杂质与DNA 相互隔离的特性,在裂解细胞前用不含 CTAB 的提取缓冲液(0. 14 mol/ L 葡萄糖、3 %可溶性PVP、10 mmol/ Lβ2巯基乙醇) 去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的[17] ;程运江等先用水饱、乙醚和1. 2～1. 5 mol/ L Na2 Cl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率[18] 。An Michiels 等用生长2～4 月的幼苗转移到暗室暗化处理4 周的黄化叶提取DNA 有效地防止多糖污染,同时发现在25 ℃异丙醇过夜沉淀DNA 能减少杂质污染且大大提高产率[19] 。关于提取DNA 中蛋白质、糖类、多酚等各种杂质对分子生物学后续试验的影响,马小军等和文晓鹏等认为在一定范围内DNA 样品中蛋白质含量的高低, 可能不是影响PCR 扩增的重要因素, 去除RNA 后尚未纯化的DNA 作为模板进行RAPD 扩增也能得到和纯化后一致的条带。但是, 用EcoRI 和HindIII 检测表明, 未纯化的DNA 不能用于酶切[20 - 21] 。目前检测DNA 的纯度最常用的方法是测定DNA 在230、260、280 nm的吸收值, 通过计算OD 260/ OD 280 来评价DNA 的纯度, 通常认为OD 260/ OD 280 在1. 8～2. 0 表明 DNA 的纯度较好。尽管这种方法用得很普遍,但并不可靠, 因为核酸在260 nm处的吸收很强,只有存在高水平蛋白质杂质时才会引起这2 个波长下吸收值的比值发生明显改变[22] 。检测DNA 纯度最佳的办法是采用EcoRI、HindIII 等限制性核酸内切酶对DNA 进行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR 模板的基因组DNA ,才能证明其纯度高,所含蛋白质、多糖类等杂质少,才能进一步用于AFLP、RFLP、Southern 杂交等分子生物学的研究。
5 展望
快速、经济地从植物样品中提取高产量、高纯度的基因组DNA 已成为植物分子生物学研究的首要问题。今后,基因组DNA 提取方法研究的发展将趋于用非有机溶剂提取法替代传统的有机溶剂提取;实现一步提取法,省去繁琐的提取和多次离心过程,更适于批量操作;利用物理吸附法,操作简便、提取效率高、对基因组DNA 没有损伤作用,适宜于自动化操作;提取过程自动化,把基因组DNA 的提取与其他分子生物学技术(毛细细管电脉,PCR ,基因芯片技术等) 结合起来,实现从样品处理到基因分析过程的全部自动化操作。
