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大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法protocol

2010/02/26 易生物实验
导读:常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化,是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补( α-互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-?-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法:

方法一:

细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷

CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。

实验步骤:

1、从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈0.4。

2、在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。

3、于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

4、倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

5、以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上。4 h

6、于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

7、倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

8、每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。

9、用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。

10、将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s~2min,不要摇动试管。

11、快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。

12、每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化,是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补( α-互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-?-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法:

方法一:

细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷

CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。

实验步骤:

1、从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈0.4。

2、在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。

3、于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

4、倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

5、以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上。4 h

6、于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

7、倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

8、每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。

9、用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。

10、将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s~2min,不要摇动试管。

11、快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。

12、每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

13、将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上

14、将平板置于室温至液体被吸收。

15、倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。

方法二:

CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞,便于质粒DNA的转化,可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点:使用方便,只需一步即可完成感受态细胞的制备;转化效率略高于CaCl2法,一般可达106-108cfu/μg,满足一般实验需要;感受态细胞制成后即可保存于 -70℃,无须加入甘油,并且经长期保存活力无明显下降。

1、从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个,分别接种5ml LB培养基中,37℃,250rpm, 过夜培养。

2、次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中(250ml 锥形瓶),37 ℃,250rpm培养2小时,此时OD600约0.4—0.5。

3、吸取1ml菌液到1.5ml离心管里,5000rpm离心5分钟,弃去上清。

4、加入100μl预冷的Solution A,悬浮菌体,冰浴30分钟。

5、此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。

注意事项:

1、所用器具一定要清洁;

2、操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的,建议装量不要高于此值:500ml 锥形 瓶装100ml培养基,250ml锥形瓶装50ml培养基;

3、在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ,效果会更好一些;

4、为保证细胞处于对数生长期,培养后的菌体的OD值不要高于0.6;

5、制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作;

6、细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击,冰浴后直接加入新鲜LB,简化操作步骤,但转化效率低于热击方法,适用于对转化率要求不高的实验。

方法三:

1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。

2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中,37℃振荡培养3h至OD600=0.3。

3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中,冰浴10min。

4、在4℃下以4000rpm离心5min,去上清液 。

5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中,置冰上30min 。

6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min,去上清液 。

7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中,冰浴放置4-12hr备用。

方法四:

1、将1ml过夜培养的细菌(如DH52、TG1、TM101)接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡,通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2~0.5(5×107cells/ml),需2~4h。

2、将培养物放于冰上致冷10min,于4℃离心细菌培养物,10000rpm离心10min。

3、弃除上清,将细菌悬浮于原始培养体积的一半(约50ml)的50mMCaCl2和10mm Tris HCl(pH8.0)无菌冷冻液体中。

4、将细菌悬浮放在冰上约5min,然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。

5、弃上清,悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris?HCl(pH8.0)无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞,即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中,贮存于-80℃冰箱中。

方法五:TSB法

实验试剂:

1M Mg2+ (1M MgSO4 和 1M MgCl2等体积混合),用0.22um滤膜超滤除菌。

TSB液(30mL/ 80mL菌液)(现配现用): PEG3350 3g ;Tryptone 0.3g ;Yeast extract 0.15g ;NaCl 0.3g ;以上 121℃, 15min 灭菌后,加入1M Mg2+600uL , 以及DMSO 3mL

实验步骤:

1、活化菌株 。

2、挑单菌落培养于5mL 的液笨培养基中。

3、取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养 。

4、370C培养3-4小时,OD600在0.4-0.6 。

5、离心,去上清 。

6、加入20mLTSB,重悬 。

7、离心,去上清 。

8、加入10mLTSB,再加入15-20%的甘油,分装保存。

注:整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备经验过程:

实验步骤:

1、将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养。

2、高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)。准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。

3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板摇瓶中。

4、37°C下剧烈振荡培养2-6小时。

5、定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) ,当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)。

6、细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)。

7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。

8、照上面步骤重复离心,小心弃去上清液。

9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。

10、离心,弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)。

11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。

12、将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存。

转化方法:

1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟。

2、添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟。

3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中。

4、加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT 。

5、对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数,应该在3以上)。

6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。

7、37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原。

8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。

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