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大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2010/04/05 易生物实验
导读:一、实验原理 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现,用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态,如

一、实验原理

体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现,用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态,如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法,其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球形,细胞膜的通透性发生改变,外源DNA附着于细胞膜表面,经42°C短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株,而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因,如抗氨卞青霉素的基因(AP+)。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上,则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞,用CaCl2处理受体菌使其处于感受态,然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释,在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增后,可将转入的质粒DNA分离提取出来,用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂

1. 仪器:

恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料

E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂:

LB培养液(1L):

胰蛋白胨 10g

酵母粉 5g

NaCl 10g(高盐)或5g(低盐)

氨苄青霉素(Ampicillin) 100mg/ml

在三角瓶中将胰蛋白胨 10g,酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃,向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨苄青霉素。然后贮存于4℃备用。

LB平板培养基:

胰蛋白胨 10g

酵母粉 5g

NaCl 10g或5g ,

琼脂 13g

在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温至50℃,取出培养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中,根据需要加入氨苄青霉素,然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。90mm直径的培养皿约需30~50ml培养基。培养基完全凝结后,倒置平皿并贮存于4℃备用。

其它试剂: 0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水

一、实验原理

体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现,用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态,如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法,其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球形,细胞膜的通透性发生改变,外源DNA附着于细胞膜表面,经42°C短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株,而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因,如抗氨卞青霉素的基因(AP+)。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上,则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞,用CaCl2处理受体菌使其处于感受态,然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释,在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增后,可将转入的质粒DNA分离提取出来,用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂

1. 仪器:

恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料

E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂:

LB培养液(1L):

胰蛋白胨 10g

酵母粉 5g

NaCl 10g(高盐)或5g(低盐)

氨苄青霉素(Ampicillin) 100mg/ml

在三角瓶中将胰蛋白胨 10g,酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃,向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨苄青霉素。然后贮存于4℃备用。

LB平板培养基:

胰蛋白胨 10g

酵母粉 5g

NaCl 10g或5g ,

琼脂 13g

在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温至50℃,取出培养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中,根据需要加入氨苄青霉素,然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。90mm直径的培养皿约需30~50ml培养基。培养基完全凝结后,倒置平皿并贮存于4℃备用。

其它试剂: 0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水

三、操作步骤

1. 感受态细菌的制备:

(1)用接种环从E.coli JM109菌平板上挑取一单克隆菌落,接种于装有5ml LB液体培养基的试管中中,37℃ 220 rpm振荡培养过夜(12~16h)。

(2)取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体培养基三角瓶中中,37℃,220 rpm振荡培养2-3h,隔20-30min测量OD600值,至OD600值为0.3-0.4。无菌条件下将细菌转至1.5ml 离心管中,每管1ml菌液,按需要决定管数。

(3) 4℃,12000 rpm,离心2 min,以回收细菌。

(4)倒净上清液,倒置离心管于滤纸上1min,使残留的痕量培养液流尽。每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞,冰浴30 min 。

(5)4℃,12000 rpm,2 min。

(6)倒净上清液,倒置离心管1min,使残留液流尽。每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重新悬浮细胞(重悬时操作要轻),即成感受态细胞悬浮液。

2.细菌转化:

(1)取3只灭菌的Ep管,分别编号1、2、3、分别加入以下各组分:加入10~20ng质粒DNA(体积小于10ul),同时做两个对照组:

1号:受体菌对照组: 100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O

2号:质粒DNA对照组:100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

3号:正常转化组:100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19

(2)轻轻旋转离心管以混匀内容物,冰浴30min,促进DNA分子在感受态细胞表面的吸附。

(3)转入42℃水浴2min,通过热刺激增强CaCL2的作用,使细胞膜产生通道,便于DNA分子的吸附进入,提高转化率。

(4)迅速转入冰上冷却2min,修复细胞膜。

(5)加600u无抗生素lLB液体培养基,摇匀后于37℃,220 rpm,振荡60min。使受体菌恢复正常生长状态,并且表达Ampicillin抗性基因。

(6)取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板,将平板置于无菌台直至液体被吸收,37℃恒温培养箱倒置培养12-16h后观察结果,其余保存于4℃。如果平板上没有长出菌落,可将之置于37℃恒温培养箱继续培养,同时将剩下的500ul菌液离心,倒掉大部分上清,留100ul左右,用移液器吹打重悬,再全部涂于含Ampicillin的LB平板上,置37℃ 培养。

(7)观察并记录转化子出现的数目,计算转化率。

四、注意事项:

1. 实验中所用的器皿均要灭菌,以防止杂菌和外源DNA的污染。

2. 实验过程中要注意无菌操作,溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。

3. 必须设对照组,以检验实验过程中是否有污染。

4. 整个实验过程均需置于冰上。

5. 选用对数生长期细胞,OD600不应高于0.6。

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